Teknikken i bioteknik
På denne side præsenterer vi de biologiske molekyler, der anvendes indenfor bioteknik og forklarer grundprincipperne for genteknik. Derefter tager vi nogle aktuelle problemstillinger op, og hvorledes disse kan løses med moderne metoder.
Bioteknikken giver nye lægemidler
Du har måske lagt mærke til, at de nye beta-interferoner kaldes ”rekombinante proteiner”. De fremstilles ved hjælp af bioteknik.
Beta-interferonerne tilhører det voksende antal lægemidler, der fremstilles på denne måde og som nu er blevet en del af vor hverdag. Nogle redder liv, medens andre forbedrer livskvaliteten for millioner af mennesker.
På trods af det vækker disse lægemidler en gang imellem uro, fordi fremstillingsmetoderne bygger på genteknik. Har du tænkt over, hvorledes ”rekombinante lægemidler” fremstilles?
En dybere forståelse af bioteknikkens grunde og metoder kan måske hjælpe til med at dæmpe uro og usikkerhed ved at skabe indsigt i, hvorfor denne metode er så værdifuld.
En definition af bioteknik
bi-o-tek-nik
Udviklingen af teknikker, der anvender biologiske processer i fremstilling af materiale for medicinsk og industriel brug. Eksempelvis er fremstillingen af mange antibiotika afhængig af forskellige svampes og bakteriers aktivitet. Nye gentekniske metoder har muliggjort fremstilling i stor skala af hormoner, vacciner, interferoner og andre anvendelige produkter.
The Oxford Concise Medical Dictionary
Værdien af bioteknik - derfor er proteiner livsnødvendige
Mange af bioteknikkens produkter er ”rekombinante proteiner”.
Proteiner er livsnødvendige strukturelle og regulerende molekyler og nogle af dem kan anvendes indenfor medicinen. Eksempelvis kan man anvende humanproteiner til at behandle sygdomme, der skyldes proteinmangel.
Man har længe kendt til værdien af humanproteiner i behandlingen af sygdomme, men man kan kun udvinde meget små mængder protein fra menneskets væv.
Takket være bioteknikken kan man imidlertid nu producere tilstrækkelige mængder humanproteiner af så god kvalitet, at de kan anvendes indenfor medicinen.
Grundprincippet er enkelt: DNA i generne koder for en skabelon, der kaldes RNA, som på sin side koder for proteiner (se diagrammet). Bioteknikken tilpasser dette princip i stor skala ved produktion af lægemidler.
De første skridt
For at forstå, hvorledes bioteknik kan anvendes til at fremstille terapeutiske proteiner, skal vi gå tilbage til 1944, hvor videnskabsmænd opdagede, at genetisk information findes lagret i deoxribonukleinsyre (DNA) i cellekernen, ikke i proteiner som man tidligere havde troet.
Denne opdagelse indebar et gennembrud, fordi den var det første skridt mod bioteknikkens allervigtigste princip, nemlig at gener bærer en kode for proteiner.
I 1953 viste Crick og Watson, hvorledes dette kunne fungere, ved at deciffrere selve DNA-strukturen ved hjælp af eksperimentelle data som blev stillet til disposition af Maurice Wilkins og Rosalind Franklin. I 1962 blev de belønnet med Nobelprisen i medicin for deres arbejde.
Crick og Watson viste, at DNA består af to meget lange kæder af enkle, tilbagevendende enheder, der snor sig om hinanden i en dobbelthelix. Hver kæde har en ”rygrad” hvorfra forskellige ”pinde” (baser) skyder indad, som i en vindeltrappe. Der findes fire forskellige: Adenin, guanin, thymin og cytosin. På grund af deres strukturelle og elektriske egenskaber danner adenin altid par med thymin og cytosin med guanin.
Kodonet knækkes
Crick og Watson indså konsekvenserne af DNA-kædens struktur. Hvis man trækker dobbelthelixen fra hinanden, får man to enkelte kæder. Basernes måde at danne par på indebærer, at hver og en af enkeltkæderne udgør en skabelon ved hjælp af hvilken en nøjagtig kopi af modermolekylet kan fremstilles.
Dette er vigtigt, eftersom arvelighed beror på nøjagtig reproduktion. På billedet til højre ser du, at dette er iboende DNA’s struktur.
- Oprindelige modermolekyle
- Førstegeneration dattermolekyle
- Andengeneration dattermolekyle
Crick og Watson foreslog, at sekvensen af baser i DNA-molekylet på en eller anden måde koder for proteiner.
I begyndelsen af 1960’erne knækkede forskerne endelig den genetiske kode. De viste, at enheden for genetisk information er en sekvens på tre baser, kaldet en kodon. Hver kodon bestemmer en enkelt aminosyre.
DNA-koden for proteiner
Der findes 21 forskellige aminosyrer, og de er alle proteiners grundlæggende byggeklodser. I et protein sammenbindes aminosyrerne ende vid ende til en lang streng, der er vredet i en kompleks tredimensionel form. En kodonsekvens i DNA, der bestemmer et proteins hele sekvens af aminosyrer, kaldes for et gen. En typisk menneskecelle har cirka 100.000 gener i sit DNA.
Således dannes et protein
Ved dannelse af et protein skilles de to DNA-strenge ad langs et gens hele længde. Derved blotlægges en skabelon, hvorpå en datternukleinsyre, kaldet ribonukleinsyre (eller RNA), kan dannes af enzymet RNA-polymerase.
Denne proces kaldes transskription, fordi genetisk information transskriberes, eller ”skrives med et andet skriftsystem (se billedet).
RNA
Når RNA-strengen er dannet, vandrer den fra kernen til cytoplasmaets store proteinbyggende fabrikker – ribosomerne – der oversætter sekvensen af kodon til den specificerede streng af aminosyrer, således at de danner et protein. Denne proces kan sammenlignes med at oversætte instruktioner fra et sprog til et andet.
Ribosomer
Fra ribosomerna mades nydannede proteiner ind i en indpakningsfabrik – det endoplasmatiske reticulum – hvor de dækkes med kulhydratkæder, så der dannes et funktionelt proteinkompleks. Denne endelige indpakning kaldes glykosylering. Den har vigtige konsekvenser for bioteknikken, hvilket vi senere vil få at se.
Bioteknikkens gennembrud
Alle celler anvender samme maskineri til at fremstille proteiner ved hjælp af DNA, t.o.m. meget enkle celler som bakterier. Faktum er, at bioteknikken først blev mulig, da flere vigtige proteiner (enzymer) blev opdaget i bakterier og virus i begyndelsen af 1970’erne. Til dem hører
- restriktionsendonukleaser (som bortskærer DNA på visse steder)
- DNA-ligaser (som limer DNA-fragmenter sammen ende mod ende)
- omvendt transskriptase (som vender transskriptionen fra RNA til DNA)
Disse enzymer er bioteknikkens værktøjer. De kan anvendes til at spalte og derefter rekombiner vigtige humane gener med bakteriers DNA.
Rekombination af humane og bakterielle gener udgør basis for rekombinant DNA-teknik, som er bioteknikkens centrale princip. Det er en værdifuld teknik, fordi bakterier deler sig meget hurtigt. Under de rette forhold fordobles antallet af bakterier hvert 20. minut. Dette indebærer, at de kan anvendes til at fremstille store mængder protein til medicinsk brug.
Den moderne syntese
Ved fremstilling af et rekombinant protein isolerer man først humant DNA og deler det op ved hjælp af en restriktionsendonukleaser. På den måde får man en mængde karakteristiske DNA-fragmenter, der indeholder visse gener.
Derefter gentager man processen med bakterielt DNA, hvoraf en del findes i cirkelformede strukturer, der kaldes plasmider. Hvis man anvender den rette ”kniv”, er det sædvanligvis nok at skære slyngen af på ét sted.
Derefter blander man et fragment af humant DNA, som bærer det gen, man behøver, med den åbnede bakterielle plasmid.
Plasmider
Endelig rekombinerer man de humane og bakterielle fragmenter med en DNA-ligase for at danne en ny plasmid, der indeholder det menneskelige gen.
Når et rekombinant DNA-plasmid er blevet fremstillet, skal det transplanteres tilbage ind i bakterierne. Således at det kan anvendes til at producere det aktuelle protein. Denne teknik kaldes transfektion. Bakterier, der indeholder det menneskelige gen i sine plasmider, dyrkes i cellekultur og begynder at syntetisere det humane rekombinante protein med deres eget cellulære maskineri.
Tænk stort
Ved hjælp af disse metoder, er det teknisk meget krævende at fremstille et rekombinant protein til medicinsk brug i industriel skala, med bl.a. varsom materialehåndtering og avanceret kvalitetskontrol.
De vigtigste produktionstrin er
- fermentering – bakterier dyrkes i en serie lukkede beholdere med en næringsbouillon (kultur)
- høst – efter fermenteringen udvinder man proteinet fra cellerne ved at centrifugere dem
- raffinering – det aktuelle protein isoleres fra cirka 5.000 normale, bakterielle proteiner med sådanne teknikker som kemisk udfældning og kromatografi
- formulering – det aktuelle protein modificeres til en stabil, steril form, der kan gives terapeutisk. Husk på, at proteiner ikke kan tages som piller, fordi de nedbrydes i maven.
Overførslen fra laboratoriets reagensglas til industriel fermentering er ikke altid en ukompliceret proces. Hvert og et af produktionstrinnene kræver flere manipulationer for at maksimere udbyttet af lægemidlet, renhedsgrad, aktivitet og stabilitet.
Dette er enkelt med visse stoffer, der kun kræver nogle få procesjusteringer. Andre er sværere og kræver mere tid og opmærksomhed, hvilket kan medføre, at prisen for slutproduktet øges. Men den bliver aldrig højere end prisen for at isolere medicinske mængder af stof fra den oprindelige kilde, hvis dette overhovedet var muligt.
Bakterier eller virus?
Ved fremstilling af rekombinante proteiner til terapeutisk brug, afhænger renhedsgraden, udbyttet, biologisk aktivitet og stabilitet også af typen af celle, der anvendes til at fremstille proteinet.
Nu om dage kan mange forskellige slags celler og bakterier anvendes. Man kan for eksempel anvende en virus til at føre menneskelige gener ind i pattedyr- eller insektcellers DNA, og dyrke disse i en kultur.
Nogle af disse celler vokser ikke særlig godt i kultur, og de fleste af dem (bl.a. bakterier) producerer forandrede proteiner, der ofte ikke er lige så terapeutisk effektive som det naturlige humanprotein.
Et svært dilemma
Den åbenlyse løsning på problemet med rekombinante proteiners formindskede aktivitet er at dyrke proteinerne i humane celler.
Desværre går det ikke at dyrke menneskeceller under de forhold, der råder ved industriel fermentering, og selvom de dyrkes i lille skala, producerer de ikke meget protein. Men takket være DNA-kodens struktur, findes der en vej ud af dette dilemma.
Som tidliger nævnt, udgør en triplet af baser koden for en aminosyre. Hvis man ændrer en eneste kodon i DNA, kan man ændre proteinets aminosyresekvens.
Præcis som i evolutionen er de fleste strukturforandringer af proteiners aminosyresekvens skadelige. En gang imellem kan de dog lede til, at originalen forbedres. En eneste forandret aminosyre kan forbedre proteinet så meget, at det får samme terapeutiske aktivitet og stabilitet som det naturlige humanprotein.
(Bildet viser en molekylær struktur hos interferon beta-1b)
Et blik ind i fremtiden
Når gener modificeres for at fremstille et protein med en noget anderledes aminosyresekvens, mister man intet af udbyttet, eftersom det nye rekombinante protein kan dyrkes i bakterier, som deler sig hurtigere end nogen anden type celler.
Der findes allerede en hel serie af modificerede (anden generation) rekombinante proteiner til medicinsk brug, deriblandt nye former for insulin, væksthormon, vævsplasminogen-aktivator, faktor VIII og interferon-beta-1b.
Dette giver nyt håb for fremtiden. Endelig er det muligt at påvirke forløbet ved sygdomme som MS. Nu, hvor bioteknikken gør det muligt at fremstille store mængder terapeutisk protein, kan alle, der har behov for det, tilbydes effektive behandlinger som beta-interferon.
